Study of body fluid samples using flow cytometry: Six years of experience at the Hospital Universitario San Ignacio - Pontificia Universidad Javeriana, Bogota - Colombia / Estudio de muestras de fluidos corporales utilizando citometría de flujo: seis años de experiencia en el Hospital Universitario San Ignacio - Pontificia Universidad Javeriana Bogotá, Colombia / Estudo de amostras de fluídos corporais utilizando citometria de fluxo: seis anos de experiencia no Hospital Universitário San Ignacio - Pontificia Universidad Javeriana, Bogotá, Colômbia

Abstract Flow cytometry (FCM) was implemented in 2008 at the Pontificia Universidad Javeriana and later at the Hospital Universitario San Ignacio to examine special samples of patients with hematological malignancies and solid tumors other than bone marrow and peripheral blood for diagnosis and monitoring. This study describes the main findings of special sample evaluation over a six-year period. In all, 1070 samples of body fluids from patients with benign and malignant diseases were examined by FCM. These samples were stabilized with TransFixTM and stained with six-color immunophenotyping panels. Samples included cerebrospinal fluid, bronchoalveolar lavage, pleural fluid, pericardial fluid and ascite fluid from patients with acute and chronic leukemia, myelodysplastic syndromes, lymphomas, myeloma, autoimmune diseases, immunodeficiencies and solid tumors, among others. Flow cytometry provided important information for the classification and detection of minimal numbers of tumor cells in leukemia and lymphoma cases. This work represents the first national report describing FCM implementation in special samples for diagnosis and clinical monitoring of patients with malignant and benign pathologies.

Resumen La citometría de flujo fue implementada en 2008 en la Pontificia Universidad Javeriana y posteriormente en el Hospital San Ignacio con el fin de examinar, para diagnóstico y monitoreo, muestras especiales de pacientes con malignidades hematológicas y tumores sólidos, distintos de los de médula ósea y sangre periférica. Este estudio describe los principales hallazgos de la evaluación de estas muestras especiales en un periodo de seis años. En total, se examinaron por citometría de flujo 1070 muestras de fluidos corporales de pacientes con enfermedades malignas y benignas. Estas muestras se estabilizaron con TransFix™ y teñidas con paneles inmunofenotípicos de seis colores. Las muestras incluyeron líquido cefalorraquídeo, lavado broncoalveolar, fluido pleural, fluido pericárdico y fluido ascítico, provenientes de pacientes con leucemia aguda y crónica, síndromes mielodisplásicos, linfomas, mieloma, enfermedades autoinmunes, inmunodeficiencias y tumores sólidos, entre otras enfermedades. La citometría de flujo proporcionó información importante sobre la clasificación y detección de números mínimos de células tumorales en casos de leucemia y linfoma. Este trabajo representa el primer reporte nacional que describe la implementación de citometría de flujo en muestras especiales para diagnóstico y monitoreo clínico de pacientes con patologías malignas y benignas.

Resumo A citometria de fluxo foi implementada em 2008 na Pontificia Universidad Javeriana e posteriormente no Hospital San Ignacio com a finalidade de examinar amostras especiais de pacientes com malignidades hematológicas e tumores sólidos diferentes aos de medula óssea e sangue periférico para diagnóstico e monitoramento. Este estudo descreve as principais descobertas a partir da avaliação de amostras especiais em um período de 6 anos. Se examinaram por citometria de fluxo um total de 1.070 amostras de fluídos corporais de pacientes doenças malignas e benignas. Estas amostras se estabilizaram com TransFix™ e coradas com painéis imunofenotípicos de seis cores. As amostras incluíram fluído cérebro-espinhal, lavado broncoalveolar, fluído pleural, fluído pericárdico e fluído ascético, provenientes de pacientes com leucemias aguda e crónica, síndromes mielodisplásicos, linfomas, mielomas, doenças autoimunes, imunodeficiência, e tumores sólidos, entre outras doenças. A citometria de fluxo proporcionou informações importantes sobre a classificação e detecção de um número mínimo de células tumorais nos casos de leucemia e linfomas. Este trabalho representa o primeiro relato nacional que descreve a implementação de citometria de fluxo em amostras especiais para diagnóstico e monitoramento clínico de pacientes com patologias malignas e benignas.

A cytotoxic Petiveria alliacea dry extract induces ATP depletion and decreases β-F1-ATPase expression in breast cancer cells and promotes survival in tumor-bearing mice

Abstract Metabolic plasticity in cancer cells assures cell survival and cell proliferation under variable levels of oxygen and nutrients. Therefore, new anticancer treatments endeavor to target such plasticity by modifying main metabolic pathways as glycolysis or oxidative phosphorylation. In American traditional medicine Petiveria alliacea L., Phytolaccacea, leaf extracts have been used for leukemia and breast cancer treatments. Herein, we study cytotoxicity and antitumoral effects of P. alliacea extract in tumor/non-tumorigenic cell lines and murine breast cancer model. Breast cancer cells treated with P. alliacea dry extract showed reduction in β-F1-ATPase expression, glycolytic flux triggering diminished intracellular ATP levels, mitochondrial basal respiration and oxygen consumption. Consequently, a decline in cell proliferation was observed in conventional and three-dimension spheres breast cancer cells culture. Additionally, in vivo treatment of BALB/c mice transplanted with the murine breast cancer TS/A tumor showed that P. alliacea extract via i.p. decreases the primary tumor growth and increases survival in the TS/A model.

Plant-based Complementary and alternative medicine used by breast cancerpatients at the Hospital Universitario San Ignacio in Bogotá, Colombia / Uso de medicina alternativa y complementaria basada en plantas, por pacientes con cáncer de seno en el Hospital Universitario San Ignacio en Bogotá, Colombia

Durante este estudio se buscó determinar la frecuencia de uso demedicina alternativa y complementaria (CAM) basada en plantas, enpacientes con cáncer de seno. Se realizó por medio de encuestas enpacientes con cáncer de seno que asistieron a consulta externa al CentroJaveriano de Oncología del Hospital San Ignacio en Bogotá en losmeses de Junio a Diciembre del 2011. De las 404 encuestas aplicadasen mujeres con cáncer de seno, el 57% consumieron algún tipo deCAM para el cáncer de seno y de estos el 76% consumieron plantasmedicinales como el anamú, la sábila, los frutos rojos y la guanábana,entre otros. El 65% de los pacientes tuvieron una percepción positivafrente al consumo de las plantas medicinales y el 57% de los usuariosde terapias basada en plantas, la uso simultáneamente al tratamientoalopático recomendado por el médico oncólogo. Concluimos quela frecuencia de uso de CAM en pacientes con cáncer de seno delCentro Javeriano de Oncología en Bogotá, esta dentro del rangode prevalencia reportado mundialmente, aunque existen diferenciasmarcadas en los tipos y frecuencias de CAM consumidas. La altaproporción de pacientes que usan CAM basada en plantas sindiscutirlo con el médico oncólogo, tiene como consecuencia la faltade evaluación con respecto a los efectos sinérgicos o antagónicos deestas terapias frente al tratamiento alopático del cáncer de mama; asícomo el potencial antitumoral y inmunomodulador real de las plantasusadas de manera tradicional por lo pacientes oncológicos...

The present study estimates the frequencyof the use of plant-based Complementary andAlternative Medicine (CAM) by breast cancer patients.From June to December of 2011, a self-administeredquestionnaire was given to 404 breast cancer patientsreceiving outpatient therapy at the Javeriana OncologyCenter of the Hospital Universitario San Ignacio inBogotá. The prevalence of patient CAM use was 57%,out of which 76% was based on plants like anamú,aloe, red fruits and soursop. Sixty-five percent of thepatients had a positive perception of using medicinalplants and 57% used them simultaneously with theoncologist recommended allopathic treatment. Weconcluded that the frequency of CAM use in breastcancer patients at the Javeriana Oncology Centeris within the prevalence range reported worldwide,despite differences in CAM types and frequencies. Thehigh rates of plant-based CAM use without physicianconsent, brings about the lack of assessment of thesynergic or antagonistic effects of CAM therapieson the allopathic treatment of breast cancer andevaluation of the antitumor and immunomodulatorypotential of the traditionally used plants...

O presente estudo se propôs a avaliar a frequência dautilização de Medicina Alternativa e Complementar (CAM) baseadaem plantas por pacientes com câncer de mama. Um questionário autoadministradofoi dado a 404 pacientes com câncer que frequentarama terapia ambulatória no Centro Javeriano de Oncologia do HospitalUniversitário San Ignacio, em Bogotá entre junho e dezembro de2011. O consumo de algum tipo de CAM por parte dos pacientesfoi de 56%. 76% selecionaram plantas como anamú, aloé , frutosvermelhos e graviola. Os resultados foram que 65% dos pacientestiveram uma percepção positiva de usar plantas medicinais. 57%dos pacientes utilizaram o tratamento alopático simultaneamente.Conclui-se que a freqüência do uso de CAM em pacientes com câncerde mama no Centro Javeriano de Oncologia está dentro da faixade prevalência registrada no mundo, embora com diferenças nostipos de CAM e freqüências. A elevada taxa de pacientes que usamCAM baseada em plantas sem consentimento médico é o resultadoda falta de respeito ou avaliação dos efeitos sinérgicos o antagônicosde terapias CAM contra o câncer da mama, bem como o potencialtratamento alopático antitumoral e imunomoduladora das plantasreais utilizados tradicionalmente...

Análisis inmunofenotípico de muestras normales de médula ósea: aplicaciones en el control de calidad en los laboratorios de citometría / Immunophenotypic analysis of normal cell samples from bone marrow: applications in quality control of cytometry laboratories / Análise imunofenotípica de amostras de medula óssea normal: aplicações no controle de qualidade em laboratórios de citometria

Objetivo. Describir un protocolo estandarizado mediante citometría de flujo para cuantificar en términos absolutos y relativos distintas subpoblaciones celulares de médula ósea normal y analizar la expresión de diferentes marcadores celulares específicos de linaje cuya reactividad está asociada a la diferenciación celular para ser usado como parte del control de calidad de rutina en los laboratorios de citometría. Materiales y métodos. El análisis inmunofenotípico de distintas subpoblaciones celulares se realizó en muestras de MO normal empleando un panel de anticuerpos monoclonales y policlonales útiles para la caracterización fenotípica de leucemias agudas en 4 fluorescencias distintas, con un protocolo que combina marcaje celular de antígenos de membrana y de citoplasma. El análisis de expresión se realizó en términos de intensidad media de fluorescencia. Para el cálculo de recuentos absolutos se adicionaron esferas fluorescentes de concentración conocida. Resultados. El panel de anticuerpos utilizado permitió la identificación y cuantificación de las distintas subpoblaciones leucocitarias normales de origen linfoide y mieloide incluyendo células precursoras CD34+, y poblaciones celulares más diferenciadas incluidas en las líneas granulocítica, monocítica y eritroide. Se establecieron los valores de referencia de las poblaciones celulares y los rangos de expresión de los diferentes marcadores celulares importantes como parte del control de calidad de rutina en los laboratorios de citometría. Conclusión. Los patrones inmunofenotípicos identificados y la determinación de los valores absolutos y relativos de referencia de las distintas poblaciones leucocitarias normales en MO podrán ser utilizados por los laboratorios de citometría como modelo para establecer parámetros de referencia en el análisis fenotípico de neoplasias hematológicas.

Objective. To describe a standardized flow cytometry protocol for the relative and absolute quantification of hematopoietic cell subpopulations from normal bone marrow, and to evaluate the expression of different lineage-specific cell markers with a reactivity associated to cell differentiation to be used as part of the routine quality control in cytometry laboratories. Materials and methods. The immunophenotypical analysis of different cell subpopulations was done with samples from normal bone marrow using a panel of monoclonal and polyclonal antibodies useful in the characterization of acute leukemias with four different fluorescences, by means of a protocol that combines cell labeling of membrane and cytoplasm antigens. Expression analysis was done in terms of mean fluorescence intensity (MFI). Fluorescent beads at a known concentration were added for calculating the absolute count of cells. Results. The antibody panel used allowed the identification and quantification of different normal leukocyte subpopulations of lymphatic and myeloid origin, including CD34+ stem cells and more differentiated cell populations in the granulocytic, monocytic, and erythroid cell lines. We established reference values for cell populations and cell marker expression ranges as part of routine quality control of cytometry laboratories. Conclusion. Immunophenotypic patterns identified as well as absolute and relative reference values for the different normal leukocyte populations from bone marrow can be used by cytometry laboratories as a basis for establishing reference parameters in phenotypic analyses of hematologic neoplasia.

Objetivo. Descrever um protocolo padronizado por citometria de fluxo para quantificar em termos absolutos e relativos diferentes subpopulações de células de medula óssea normal e analisar a expressão de diferentes marcadores celulares de linhagem específica, cuja reatividade é associada com a diferenciação celular para ser usado como parte do controle de qualidade de rotina nos laboratórios de citometria de fluxo. Materiais e métodos. A análise imunofenotípica das subpopulações de células foi realizada em amostras de MO normais utilizando um painel de anticorpos monoclonais e policlonais úteis para a caracterização fenotípica de leucemia aguda em quatro fluorescências, com um protocolo que combina rotulagem celular de antígeno de membrana celular e de citoplasma. A análise de expressão foi realizada em termos de intensidade média de fluorescência. Para calcular a recontagem absoluta foram adicionadas esferas fluorescentes de concentração conhecida. Resultados. O painel de anticorpos utilizado permitiu a identificação e quantificação das subpopulações de leucócitos normais de origem linfóide e mielóide incluindo as células precursoras CD34+, e populações de células mais diferenciadas incluídas nas linhas granulocítica, monocítica e eritróide. Foram estabelecidos os valores de referência das populações celulares e os intervalos de expressão dos diferentes marcadores celulares importantes como parte da rotina de controle de qualidade em laboratórios de citometria. Conclusão. Os padrões imunofenotípicos identificados e a determinação dos valores absolutos e relativos de referência das diferentes populações de leucócitos normais em MOM podem ser utilizados pelos laboratórios de citometria como um modelo para estabelecer parâmetros de referencia na análise fenotípica de neoplasias hematológicas.

A fraction from Petiveria alliacea induces apoptosis via a mitochondria-dependent pathway and regulates HSP70 expression / Una fracción de Petiveria alliacea induce apoptosis dependiente de la mitocondria y regula la expresión de la proteína HSP70 / Uma fração de Petiveria alliacea induz apoptose dependente da mitocôndria e regula a expressão da proteína HSP70

Objective. To evaluate the biological activity of Petiveria alliacea extracts on tumoral cells in vitro. Materials and methods. P.alliacea fractions prepared by a bioguided purification protocol were characterized by their biological activities on two human tumoral cell lines. Morphological changes, cell viability, mitochondrial membrane depolarization, nuclear staining and activity on HSP70 were analyzed. Results. The present study demonstrates that P.alliacea fractions can induce apoptosis in a mitochondria-dependent pathway and down regulate HSP70 expression in vitro. The possible compounds present in P.alliacea responsible for the described biological activities were identified by dereplication methods. Conclusion. The present study provides new knowledge on the antitumoral properties of the plant species P. alliacea described in several ethnobotanical studies.

Objetivo. Evaluar la actividad biológica in vitro de extractos de Petiveria alliacea utilizando líneas celulares tumorales. Materiales y métodos. Las fracciones de P.alliacea fueron preparadas mediante un protocolo de purificación biodirigido. La actividad biológica fue caracterizada utilizando dos líneas celulares tumorales de origen humano, donde se analizaron los cambios morfológicos, la viabilidad celular, la actividad sobre la membrana mitocondrial y la fragmentación nuclear. Asimismo se evaluó la actividad de las fracciones sobre la expresión de la proteína HSP70. Resultados. El presente estudio muestra que las fracciones de P.alliacea inducen muerte celular por apoptosis dependiente de la mitocondria y además regulan negativamente la expresión de la proteína HSP70. Los compuestos que posiblemente son responsables de la actividad biológica presente en las fracciones de P.alliacea fueron identificados por dereplicación. Conclusión. El presente estudio contribuye a explicar en parte las propiedades antitumorales de la planta P.alliacea descritas en diversos escritos etnobotánicos.

Objetivo. Avaliar a atividade biológica in vitro de extratos de Petiveria alliacea utilizando linhagens de células tumorais. Materiais e métodos. Frações de P.alliacea foram preparadas utilizando um protocolo de purificação bio-dirigido. A atividade biológica foi caracterizada utilizando duas linhagens de células tumorais de origem humana, onde se analisaram as alterações morfológicas, a viabilidade celular, a atividade na membrana mitocondrial e a fragmentação nuclear. Também se avaliaram a atividade das frações sobre a expressão da proteína HSP70. Resultados. Este estudo mostra que as frações de P.alliacea induzem a morte celular por apoptose dependente da mitocôndria e também regulam negativamente a expressão da proteína HSP70. Os compostos que provavelmente são responsáveis pela atividade biológica presente nas frações de P.alliacea foram identificados por dereplicação. Conclusão. Este estudo ajuda a explicar, em parte, as propriedades antitumorais da planta P.alliacea descrita em vários escritos etnobotônicos.

Producción de anticuerpos IgG1 anti-glucuronoxilomanana en ratones resistentes a la criptococosis / Anti-glucuronoxylomannan IgG1 specific antibodies production in Cryptococcus neoformans resistant mice

Cryptococcus neoformans is a widely disseminated fungus shown to be responsible for infections in individuals with impaired cell mediated immunity, such as patients with human immunodeficiency virus (HIV). Cryptococcus neoformans has a polysaccharide capsule composed of glucuronoxylomannan (GXM), which acts as a major virulence factor and is considered to be a thymus independent type-2 antigen (TI-2). Objective. In the current study, the production kinetics were evaluated for IgG subclasses specific for GXM, and assessed with the cross reactive antibodies to Streptococcus pneumoniae polysaccharide. In addition, spleen B cell subpopulations were quantified in murine models of cryptococcosis with different susceptibilities to the infection. Materials and methods. Antibodies were detected by ELISA at different time intervals after C. neoformans infection in moderately resistant (Balb/c), highly resistant (CBA/j) and susceptible (C57BL/6) mouse strains. B cells subpopulations were determined by flow cytometry analysis. Results. Early production of IgG1, described as protector antibodies, coincided with a decrease of the number of C. neoformans colony forming units in the lungs. Polysaccharide cross-reactive antibodies were detected in each of the three mouse strains. Antibody titers were highest in the susceptible strain (C57BL/6), a strain which also showed the highest proportion of splenic CD5+ B lymphocytes. In contrast, CBA/J mice showed the highest levels of CD43+ B. Conclusions. These findings suggest that IgG1 antibodies specific for GXM, are implicated in host protection against C. neoformans infection and may be regulated by CD43+ cells. They also suggest that cross reactivity antibodies are not important in the protection against C. neoformans infection

Presencia del virus de Epstein-Barr en casos colombianos de linfoma de Hodgkin y su relación con la respuesta al tratamiento / Epstein-Barr virus presence in Colombian Hodgkin lymphoma cases and its relation to treatment response

En el desarrollo y patogénesis del linfoma de Hodgkin se ha propuesto al virus de Epstein-Barr como posible factor etiológico debido a la detección de ADN viral en las células de Reed-Sternberg en un subgrupo de tumores y a los altos niveles de expresión de la proteína latente de membrana 1 (LMP-1). El objetivo de este estudio fue determinar la presencia de virus de Epstein-Barr en 67 ganglios linfáticos de pacientes con diagnóstico confirmado de linfoma de Hodgkin mediante hibridación in situ para la detección de transcritos de ARN del virus de Epstein-Barr e inmunohistoquímica para la detección de la proteína oncogénica LMP-1. La presencia del virus se relacionó con el subtipo histológico, la respuesta al tratamiento de los pacientes y el fenotipo del infiltrado linfocitario. En el 67% de los casos se detectaron transcritos de virus de Epstein-Barr, la proteína LMP-1 se detectó en 56,7% de los casos en la célula tumoral de Reed-Sternberg. La presencia del virus en cada tipo histológico fue de 69,81% en esclerosis nodular, 85,71% en celularidad mixta y 40% en clásico. El virus de Epstein-Barr se detectó con mayor frecuencia en niños (84,2%) en comparación con los adultos (60,4%) y los pacientes positivos para el virus mostraron mejor respuesta al tratamiento, reflejada en una menor tendencia a presentar recaídas. El análisis del infiltrado mostró un predominio de linfocitos T CD4 y presencia de linfocitos T CD8, con mayor expresión de ambas subpoblaciones en casos positivos para virus de Epstein-Barr. Los resultados muestran un alto porcentaje de infección por virus de Epstein-Barr con una probable implicación significativa en la respuesta al tratamiento, lo que sugiere que la detección de virus de Epstein-Barr se podría usar como marcador de pronóstico en este tipo de linfoma.

The role of Epstein-Barr virus as etiologic agent in Hodgkin lymphoma (HL) development has been supported by the detection of viral DNA in the Reed-Sternberg cell in a subset of HL, and the high levels of latent membrane protein 1 expression in these tumors. To gain further evidence of this relationship, lymph nodes from 67 patients with HL were analyzed for the presence of Epstein-Barr virus using EBERs in situ hybridization and LMP-1 immunohistochemistry. Virus presence was related to histological subtype, patients´ treatment response and tumor infiltrating lymphocytes phenotype. EBERs transcripts were found in 67% of the cases and LMP-1 in the Reed-Sternberg tumor cells at a 56.7% rate. The prevalence, as determined by histological subtype, was 69.81% for nodular sclerosing, 85.71% for mixed cellularity and 40% for lymphocyte-rich. Epstein-Barr virus presence was more frequent in children (84.2%) in comparison with adults (60.4%). Positive patients presented higher failure-free survival rates than Epstein-Barr virus negative patients. CD4 positive infiltrating T cells were present in a higher proportion in relation to CD8 positive T infiltrating cells, the mean percentages for both subsets were higher in Epstein-Barr virus positive cases. A high percentage of Epstein-Barr virus was present in HL with a probable association with treatment response. This suggests an application of Epstein-Barr virus detection to use as a prognosis marker in treatment response for HL cases.

Expresión de proteínas del choque térmico HSP72 y HSP73 en casos colombianos de Linfoma de Hodgkin positivos y negativos para virus de Epstein Barr / Expression of heat shock proteins HSP72 and HSP73 in Epstein-Barr positive or negative Hodgkin lymphoma

Background: The expression of heat shock proteins (HSP70) in tumor cells or virus infected cells is important for the induction of specific cellular immune response. They are implicated in transport of immunodominants peptides in the endoplasmic reticulum, activation of antigen presenting cells and cross priming of CD8 T cells. Aim: To analyze the expression of HSP70 protein in its constitutive (HSP73) and inducible forms (HSP72) in Hodgkin's lymphoma (HL), infected or not by Epstein Barr virus (EBV) and to assess its relationship with pathological subtype, clinical stages and treatment response. Material and methods: The analysis of HSP73 and HSP72 was done by immunoperoxidase on routinely processed paraffin sections with prior antigen retrieval. Results: Sixty seven cases were studied. The expression of HSP73 and HSP72 was detected in 19.4 and 17.9% of samples respectively. The infiltrating lymphocytes expressed HSP72 in 58% of cases. The pathological subtypes with the higher expression in lymphocytes were mixed cellularity and nodular sclerosis. No differences in HSP70 expression were observed, according to clinical stage, treatment response or the presence of EBV. Conclusions: The expression of HSP72 on lymphocytes suggests that this protein plays an important role in the induction and amplification of anti-tumor immune response (Rev Méd Chile 2003; 131: 1375-81).

Sensibilización alérgica a los alimentos tropicales usados en la ablactación

Se estudiaron 160 individuos sanos menores de dos años mediante la técnica de Inmunodot para determinar la presencia de Ig E sérica específica frente a los 10 alimentos tropicales de mayor consumo. Se encontró que el 23.12 por ciento de los pacientes presentaron sensibilización a dichos alimentos, siendo los más frecuentes maíz, banano y guayaba. Esta sensibilización tiende a disminuir hacia los 24 meses. Se sugiere que la introducción temprana de estos alimentos debe considerarse como factor predisponente a la posterior presentación de alergia